Уургийн молекул жинг олох арга нь хими, физик-хими, физик юм. Физик-химийн хамгийн түгээмэл аргууд бол гель хроматографи (багана ба нимгэн давхарга хоёулаа) ба натрийн додецил сульфаттай полиакриламидын гель орчинд электрофорез хийх явдал юм. Тэд нарийн төвөгтэй төхөөрөмж, их хэмжээний туршилтын материал шаарддаггүй.
Уургийн шинж чанар
Уураг нь биологийн гаралтай өндөр молекул жинтэй полимер юм. Эдгээр нь пептидийн бондоор цувралаар холбогдсон амин хүчлүүдээс тогтдог. Уургийн хэмжээ нь эдгээр амин хүчлүүдийн тооноос хамаарна. Уургийн элементийн найрлагын дундаж утга %:
- нүүрстөрөгч - 50, 6-54, 5;
- хүчилтөрөгч – 21.5-23.5 дотор;
- азот - ойролцоогоор 15.0-17.6;
- устөрөгч - 6, 5-7, 3;
- хүхэр – 0, 3-2, 5 дотор;
- эрдэс бодис - 0.5-аас ихгүй.
Уургууд нь зөвхөн амин хүчлийн үлдэгдлээс бүрдэх энгийн, нийлмэл, протезийн бүлэгт хуваагддаг. Уургийн бус бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь нүүрс ус, липид, нуклейн хүчил, витамин дериватив, металлын ион, гем гэх мэт байж болно. Уургийн дөрвөн бүтэц байдаг.
Уургийн амин хүчлийн найрлагыг ион солилцооны хроматографи ашиглан ялгарсан амин хүчлүүдийг дараа нь ялгахтай хослуулан хүчлийн гидролизийн аргаар олдог.
Амин хүчлүүд тус бүрийн тоон үзүүлэлтийг нинидриний аргаар тодорхойлно. Уургийн молекул дахь амин хүчлүүдийн байршлыг илрүүлэх нь ферментийн тусламжтайгаар төгсгөлийн амин хүчлүүдийг дараалан задалж, тэдгээрийг тодорхойлох замаар хийгддэг бөгөөд энэ нь уургийн молекулын бүтцийг тодорхойлох боломжийг олгодог. Тодорхойлолт нь тэдгээрийн янз бүрийн физик-химийн шинж чанарт суурилдаг. Үүнд ихэвчлэн тодорхой амин хүчлийн өнгөт урвал, хроматографийг ашигладаг.
Багананы гель хроматографи
Энэ арга нь олон бөмбөрцөг уургийн молекул жингийн логарифмын шугаман хамаарал ба дүүргэсэн гель (тодорхой нүхний хэмжээтэй) уусмалын эзэлхүүн дээр суурилдаг. Тиймээс уургийн молекулын жинг тодорхойлохын тулд зөвхөн урьдчилан тохируулсан баганаас түүний элюцийн эзэлхүүнийг олох хэрэгтэй. Шалгалт тохируулга нь урьдчилан тодорхойлсон масстай уурагуудыг баганаар дамжуулж, тус бүрийн шүүрлийн хэмжээг хэмжих замаар хийгддэг. Хэрэв Sephadex G-75-ийг дүүргэгч болгон ашигладаг бол молекулын жингийн тооцоог туршилтаар олсон тэгшитгэлийн дагуу гүйцэтгэнэ:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), Энд M нь хүссэн молекул юмжин; Ve – баганаас гарч буй шинжилгээний бодистой уусмалын эзэлхүүн; Vo – чөлөөт баганын хэмжээ.
Шинжилгээнд хөх декстраны уусмал (1%), NaCl-ийн уусмал (0.1 моль/л), Sephadex G-75 (4 гр), гемоглобины уусмал (1%) хэрэгтэй болно.
Шинжилгээ хийх
Бэлтгэсэн баганыг Sephadex G-75 гельээр дүүргэж NaCl уусмалаар угаана. Гель түвшнээс дээш гарсан NaCl уусмалыг шавхсны дараа түүний гадаргуу дээр 0.5 мл цэнхэр декстраны уусмалыг болгоомжтой хийнэ. Дараа нь баганаас гарч буй шингэнийг дүүргэсэн цилиндрт цуглуулж, туршилтын төгсгөл хүртэл хадгална. Цэнхэр өнгөтэй, урсаж эхэлдэг уусмалыг урьдчилан бэлтгэсэн туршилтын хоолойд 20 дусал дуслаар цуглуулдаг. Тэдгээрийн элюатыг эхнийхээс хамгийн эрчимтэй өнгөөр будаж, өнгөгүй фракцуудыг аль хэдийн цуглуулсан ижил төгссөн цилиндрт хийнэ. Уусмалын өнгөө алдсан туршилтын хоолойн эзэлхүүнийг тооцохгүй.
Төгссөн цилиндрт хуримтлагдсан шингэний эзэлхүүн нь баганын чөлөөт эзэлхүүн юм (Vo). Дараа нь баганыг дүүргэх нь давтагдах боловч хөх декстриний оронд гемоглобины уусмалыг хэрэглэдэг. Хамгийн их ягаан өнгөтэй уусмал гарах хүртэл хэмжих цилиндр дэх элюатын эзэлхүүн нь Ve байна. Олдсон Vo ба Ve утгуудыг харгалзах тэгшитгэлд орлуулж, уургийн массыг тооцоолно. Уургийн амин хүчлийн найрлагыг ижил төстэй аргаар олдог.
Нимгэн давхаргатай гель-хроматографи
Энэ аргын зарчим нь уургийн уусмалыг Sephadex-ийн хамгийн нимгэн давхаргатай хавтан дээр дэвсэх явцад тэдгээрийн хольц жигд бус тархдагт оршино. Анхны эхлэлийн шугамаас уураг тус бүрийн туулсан зайнаас тэдгээрийн молекул жингийн логарифмуудыг ол. Нимгэн давхаргат гель хроматографийн аргаар уургийн молекулын жинг тодорхойлохын тулд маркер уургуудын туулсан зайн тэдгээрийн молекул жингийн логарифмээс хамаарлыг тусгасан тохируулгын графикийг байгуулна. Үүнийг аль хэдийн ашиглаж байгаа үед судалж буй уургийн замын урт, молекулын масс олддог.
Туршилтыг хийхийн тулд танд хувьсах налуу өнцөг бүхий шат, түүнчлэн хроматографийн камер хэрэгтэй болно. Урвалжуудаас танд Sephadex G-200 эсвэл G-150, натрийн фосфатын буфер, рН 7.4 (0.1 моль/л), бромофенолын цэнхэр уусмал (0.1%), CH 3уусмалхэрэгтэй болно. COOH (5%), CH3COONa уусмал (2%), уургийн тэмдэглэгээний хэрэгсэл, хроматографийн цаас.
Туршилт хийж байна
Эхлээд Sephadex гель бэлтгэх шаардлагатай бөгөөд үүний тулд түүний хуурай масс 4 г илүүдэл натрийн фосфатын буферт уусгаад n.o.-д 3 хоног хавагнах хэрэгтэй. 20х40 см-ийн талтай шилэн хавтанг сайтар угаана. Сефадекс түрхэхээсээ өмнө түүний дээрх буферийг буулгаж, дараа нь гель сайтар холино. Үүнийг хэвтээ байрлалтай тавган дээр шаазан халбагаар түрхэж, дараа нь 1х22 см хэмжээтэй шилэн саваа өнхрүүлэн тарааж, 1 мм зузаантай бөөгнөрөл, бөмбөлөггүй гель давхарга жигд тархах хүртэл өнхрүүлгийг давтан хийнэ. Бэлтгэсэн хавтанг 15 минутын турш агаарт хатааж, дараа нь хроматографийн камерт хийнэ.
Фосфатын буферийг гаднах саванд хийнэ, гель нь хроматографийн цаас бүхий буфертэй холилдоно. Дараа нь танхимыг хааж, тусгай тавиур дээр байрлуулна. Түүний налуу өнцгийг 7-10 ° -аар тогтооно. Тасалгааг ханахын тулд шөнөжин үлдээгээрэй.
Молекул жин нь мэдэгдэж байгаа уургийн уусмал, мөн судалж буй дээжийг микропипеткээр түрхэж, хэсэг тус бүрийн эзэлхүүн нь 0.02 мл байх ёстой. Хавтанг хэвтээ байрлалд буцааж, уургийн хэсгүүдийг тодорхой цэгүүдэд хэрэглэнэ. Тэдний хоорондох зай ба дээд ирмэгээс 3 см байх ёстой Дараа нь танхимыг хааж, 7-10 ° өнцгөөр байрлуулна. Гель хроматографийн шинжилгээг 4 цагийн турш хийнэ.
Тогтоосон хугацааны дараа камерыг хэвтээ байрлуулж, хроматографийн цаасыг арилгана. Шилэн хавтанг хэвтээ байрлалтай тавиур дээр байрлуулж, хроматографийн цаасан дээр "хуулбар" хийдэг. Үүнийг хийхийн тулд хоолой руу өнхрүүлж, нимгэн гель давхаргад түрхэж, аажмаар задлана. Энэ тохиолдолд цаас нь наалдсан байх ёстой, гэхдээ та үүнийг бүрэн бүтэн байлгахын тулд болгоомжтой хийх хэрэгтэй. Цаасыг хавтангийн гадаргуу дээр 1 минутын турш үлдээж, дараа нь 90 градусын температурт 20 минутын турш хатаана. мөн тусгай будгийн саванд хийнэ.
Үр дүнгийн хуулбар
Уургийн бүсийг тодорхойлохын тулд "хуулбар"-ыг бромофенолын цэнхэр уусмалд 3 минутын турш байрлуулна. Цаашидбудгийг цууны хүчлийн уусмалаар хоёр удаа угааж, натрийн ацетатаар бэхэлсэн байх ёстой. Үүний дараа хроматографийн цаасыг хүйтэн урсгал усаар сайтар угааж, хатаана. Дараа нь тэд уураг бүрийн эхлэлийн цэгээс цэгийн төв хүртэлх замыг хэмжиж эхэлдэг.
Авсан өгөгдлийн дагуу абсцисса тэнхлэгийн дагуу lа/lst (энд a индекс нь дүн шинжилгээ хийсэн, st - стандарт уураг), y тэнхлэгийн дагуу - lgM. Туршилтын дээжийн уургийн бүсийн зайг эхнээс нь хэмжсэнээр молекулын жин болон уургийн молекулын санал болгож буй бүтцийг зурсан график ашиглан тодорхойлно.
